Nacido en enero del año 1500 en Almodóvar del Campo, cursa los estudios universitarios de Filosofía y Derecho en Salamanca y de Teología en Alcalá, como discípulo predilecto de Domingo Soto. También los libros de Erasmo, saturados de espíritu paulino y ansiosos de re forma, le influyeron mucho. Fue el discípulo más aventajado, dice Fray Luis de Granada.

Corría el año 1517 cuando Juan de Ávila, estudiante de Salamanca, oyó la voz del Señor cerca de él no ya en la ribera del Lago de Galilea, sino en el bullicio de una fiesta de toros y cañas. Pero el eco que produce en su alma le lleva a dejarlo todo.

Ordenado sacerdote el 1525, celebra su Primera Misa y sueña con el nuevo mundo americano cuyas primicias están llegando a España. Dios tenia señalado otro campo de acción: para su apostolado, se convertirá en el apóstol de Andalucía. Recorre Écija, Sevilla, Córdoba, Granada. predicando con acentos patéticos, la conversión de los pecados y ganando para su causa a algunos sacerdotes, con los que organiza una Congregación de Operarios para sembrar la Palabra de Dios. Cuando más tarde mande al Concilio de Trento un memorial sobre las necesidades de la Iglesia, señalará entre las principales la de curas confesores y predicadores: sus compañeros han de intentar cubrir esta última necesidad. Funda junto con ellos hasta quince colegios en los que como el mismo afirmaba, se aprendía no tanto a gastar los ojos en el estudio cuanto a encallecer las rodillas en la oración.

Fervoroso y mortificado, incluso más hombre de oración que de palabra, Juan de Ávila sigue su camino encendiendo inquietudes de más exigente espiritualidad en seglares, clérigos y religiosos; por ejemplo, en carmelitas, como san Juan de la Cruz, en dominicos como fray Luis de Granada, que será su primer biógrafo.

Mantuvo comunicación con Santa Teresa de Jesús, San Pedro de Alcántara y San Francisco de Borja.

Entre sus muchos convertidos a una vida santa descuella San Juan de Dios.

Juan mantuvo intimas relaciones con Ignacio de Loyola y su recién fundada Compañía, hasta el punto de que, uno de los hijos de Ignacio, el P. Villanueva, escribía a su santo fundador: «En tanta conformidad parece que quepa otro acuerdo: o que él se una a nosotros o que nosotros nos unamos a él». En realidad, varios de los discípulos de Juan ingresarían en la Compañía de Jesús al llegar días de persecución inquisitorial para Juan y su principal obra, el Audi, filia. Acosado por múltiples adversidades y minada su salud con tanto trabajo y penitencia, se retira a Montilla, sin fuerzas ya siquiera para predicar—salvo en las grandes solemnidades y casi sin voz—. Pronunciando reiteradamente los sagrados nombres de Jesús y María se apaga aquella luz que a .tantos había llevado hacia la conversión, era el 10 de mayo 1569.

Junto a su devoción a la Eucaristía, destacaba también su piedad mariana. Hasta llegar a escribir familiarmente: "más quisiera estar sin pellejo que sin devoción a Nuestra Señora".

Fue canonizado en 1970 y es el patrono del clero secular español.